Extraction de l'ADN plasmidique
Introduction
Les plasmides bactériens sont des petits fragments d'ADN circulaire, autonomes et mobiles qui se trouvent dans la cellule bactérienne indépendamment du génome [14]. L'extraction du plasmide repose sur une méthode de séparation différentielle dite lyse alcaline qui permet de récupérer sélectivement l'ADN plasmidique tout en éliminant l'ADN chromosomique en se basant sur la différence de leurs tailles [15].
Objectifs
Ce travail pratique permet l'apprentissage des méthodes de l'extraction de l'ADN plasmidique au laboratoire de biologie moléculaire , depuis la suspension bactérienne jusqu'au plasmide extrait.
Matériels et réactifs
Afin de réaliser ce travail pratique requis les différentes techniques et matériel utilisés au laboratoire sont:
Récupération et lavage des cellules bactériennes
-Prélever 1.5mlde suspension bactérienne et placer dans un micro tube stérile.
-Centrifuger à 12000 g pendant 3 minutes.
-Eliminer le surnageant.
-Ajouter 1.5ml de la suspension bactérienne.
Centrifuger à 12000 g pendant 3 minutes.
Eliminer le surnageant.
Remettre le culot en suspension dans 150 Ml de tampon(Tris- HCL, EDTA)
Lyse alcaline:
la méthode est décrite dans la vidéo ci-dessous.
Purification de l'ADN plasmidique
-Centrifuger à 12000g pendant 10 minutes à températures ambiante.
-Récupérer le surnageant(volume V).
Précipitation de l'ADN plasmidique
-Ajouter 2 volumes(2V) d'éthanol absolu (qui peut être remplacé avec IV d'isopropanol).
-Centrifuger à 12000 g à 4°c pendant 15 minutes.
-Eliminer le surnageant.
-Remettre le culot en suspension dans 300 ml d'éthanol à 75 %
-centrifuger à 1200 g à 4° C pendant 15 minutes
-Eliminer du surnageant
-Sécher le culot pendant quelques minutes à 37°C pour éliminer l'éthanol
-Remettre le culot en suspension dans 50mld'eau stérile ou du tampon TE.